כאשר לומדים חומרים בכימיה אורגנית, משתמשים ביותר מתריסר תגובות איכותיות שונות כדי לקבוע את התוכן של תרכובות מסוימות. ניתוח חזותי כזה מאפשר לך להבין מיד אם החומרים הדרושים קיימים, ואם הם אינם קיימים, אתה יכול להפחית באופן משמעותי ניסויים נוספים כדי לזהות אותם. תגובות אלו כוללות נינהידרין, שהוא העיקרי בקביעה חזותית של תרכובות אמינו.
מה זה?
נינהרין היא תרכובת דיקרבוניל המכילה טבעת ארומטית אחת עם הטרו-מחזור מחובר אליה, שלאטום השני שלה יש 2 קבוצות הידרוקסיל (OH-). חומר זה מתקבל על ידי חמצון ישיר של איננדיון - 1, 3, ולכן, על פי המינוח הבינלאומי, יש לו את השם הבא: 2, 2 - dihydroxyinandione -1, 3 (איור 1).
נינהרין טהור הוא גביש צהוב או לבןצבעים שבחימום מתמוססים היטב במים ובממיסים אורגניים קוטביים אחרים, כמו אצטון. מדובר בחומר מזיק למדי, אם הוא בא במגע עם העור בכמויות גדולות או בריריות, הוא גורם לגירוי, כולל בשאיפה. עבודה עם תרכובת זו צריכה להיות זהירה ורק עם כפפות, שכן כאשר היא באה במגע עם העור, היא מגיבה עם חלבוני תאי העור ומכתימה אותו בסגול.
חומרים ריאקטיביים
כפי שהוזכר לעיל, תגובת הנינהידרין משמשת בעיקר לקביעה ויזואלית של תכולת תרכובות אמינו:
- α-חומצות אמינו (כולל בחלבונים);
- סוכרי אמינו;
- אלקלואידים המכילים –NH2 ו-NH קבוצות;
- אמינים שונים.
יש לציין שאמינים משניים ושלישוניים מגיבים לעתים חלש מאוד, ולכן יש צורך במחקר נוסף כדי לאשר את נוכחותם.
לקביעה כמותית נעשה שימוש בשיטות שונות של כרומטוגרפיה, למשל, כרומטוגרפיה של נייר (BC), כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) או עם שטיפה של נשאים מוצקים עם תמיסה של נינהידרין במדיות שונות.
תגובה זו אינה ספציפית לתרכובות אמינו, מכיוון שהריאגנט יכול להיכנס אליה בבת אחת. עם זאת, מצד תוצרי התגובה, יש לו ייחוד בצורה של שחרור בועות פחמן דו חמצני (CO2), וזה אופייני רק באינטראקציה עם α-amino חומצות.
תכונות מנגנון
Bישנן פרשנויות שונות של משוואת התגובה הנינהידרין בספרות. יש חוקרים שמשמיטים את היווצרות ההידרינדנטין מ-2-aminoinandione, אשר בהשתתפות אמוניה ונינהדרין, יוצר גם חומר צביעה הנקרא "סגול רומן" (או "כחול רומן"), בעוד שאחרים, להיפך, מניחים רק את זה. השתתפות ללא נוכחות של מוצרי אמינו ביניים. יש גם כמה נקודות מעניינות בתיעוד של התגובה עצמה, בפרט, זה נוגע לשיטות של הצמדת נגזרת האמינו של נינהידרין למולקולה הראשית שלו כדי ליצור צבע. גם האינדיקציה של מקומו של "המימן ההולך" שמתקבל על ידי האמין הביניים מהתווך המימי נותרת בספק: הוא יכול להיות בקבוצת הקטון או ליד –NH2.
במציאות, הניואנס עם אטום H הוא חסר משמעות, שכן מיקומו בתרכובת אינו ממלא תפקיד מיוחד במהלך התגובה, ולכן אין לשים לב אליו. באשר להשמטת אחד השלבים האפשריים, הסיבה כאן נעוצה בהיבט התיאורטי: עד כה, המנגנון המדויק להיווצרות הסגול של רומן לא נקבע במדויק, ולכן ניתן למצוא סכמות שונות למדי של תגובת הנינהדרין.
מהלך האינטראקציה השלם ביותר האפשרי של המגיב עם תרכובות אמינו יוצע להלן.
מנגנון תגובה
ראשית, נינהידרין יוצר אינטראקציה עם חומצת אמינו α, מחבר אותה לאתר של ביקוע קבוצות הידרוקסי ויוצר תוצר עיבוי (איור 2א). ואז האחרון נהרס, משחרר את האמין הביניים, אלדהיד ופחמן דו חמצני (איור 2ב). מהתוצר הסופי בעת ההצטרפותninhydrin, המבנה הסגול Rueman (diketonhydrindenketohydrinamine, איור 2c) מסונתז. כמו כן, מצוינת היווצרות אפשרית של הידרינדנטין (נינהידרין מופחת) מהאמין הביניים, שהופך גם לתרכובת צביעה בנוכחות אמוניה (ליתר דיוק, אמוניום הידרוקסיד) עם עודף של המגיב עצמו (איור 2ד).
היווצרות ההידרינדנטין הוכחה על ידי רומן עצמו כאשר מימן גופרתי פועל על מולקולת הנינהדרין. תרכובת זו מסוגלת להתמוסס בנתרן קרבונט Na2CO3, לצבוע את התמיסה באדום כהה. וכאשר מוסיפים חומצה הידרוכלורית מדוללת, משקעים הידרינדנטין.
ככל הנראה, האמין הביניים, הידרידנטין, נינהידרין ומבנה הצבע, עקב חוסר היציבות שלהם בחימום, נמצאים בשיווי משקל כלשהו, המאפשר נוכחות של מספר שלבים נוספים.
מנגנון זה מתאים להסבר תגובת נינהידרין עם תרכובות אמינו אחרות, למעט תוצרי לוואי הנובעים מסילוק שאר המבנה מ-NH2, -NH או -N.
בדיקת ביורט ותגובות אחרות לחלבונים
ניתוח איכותי לקשרי פפטידים אפילו של מבנים שאינם חלבונים יכול להתבצע לא רק בהשתתפות המגיב הנ"ל. עם זאת, במקרה של תגובה נינהידרין לחלבונים, האינטראקציה לא מתרחשת לאורך קבוצות –CO-NH‒, אלא לאורך קבוצות אמינים. יש מה שנקרא "תגובה ביורטית", המאופיינת בהוספת יונים לתמיסה עם תרכובות אמינונחושת דו ערכית מ-CuSO4 או Cu(OH)2 במדיום אלקליין (איור 3).
במהלך הניתוח, בנוכחות המבנים הדרושים, התמיסה הופכת לכחול כהה עקב קשירת קשרי פפטידים לקומפלקס צבע, המבדיל מגיב אחד למשנהו. זו הסיבה שתגובות הביורט והנינהידרין הן אוניברסליות ביחס למבנים חלבוניים ולא חלבוניים עם קבוצת –CO-NH‒.
בעת קביעת חומצות אמינו מחזוריות, נעשה שימוש בתגובת קסנטופרוטאינים עם תמיסה מרוכזת של חומצה חנקתית HNO3 , המעניקה צבע צהוב בעת חניקה. טיפת מגיב על העור מציגה גם צבע צהוב על ידי תגובה עם חומצות האמינו בתאי העור. חומצה חנקתית עלולה לגרום לכוויות ויש לטפל בה גם עם כפפות.
דוגמאות לאינטראקציה עם תרכובות אמינו
תגובת נינהידרין לחומצות אמינו α נותנת תוצאה ויזואלית טובה, למעט מבני הצבע פרולין והידרוקסיפרולין, המגיבים עם היווצרות צבע צהוב. הסבר אפשרי להשפעה זו נמצא בתנאים סביבתיים אחרים של האינטראקציה של נינהידרין עם מבנים אלה.
תגובה עם קבוצת אמינו
מכיוון שהבדיקה אינה ספציפית, זיהוי ויזואלי של אלנין באמצעות תגובת הנינהדרין בתערובת אינו אפשרי. עם זאת, על ידי כרומטוגרפיית נייר, כאשר שמים דגימות של חומצות אמינו שונות, ריסוסן בתמיסה מימית של נינהרין ופיתוח במדיום מיוחד, ניתןחשב את ההרכב הכמותי לא רק של התרכובת הנטענת, אלא גם של רבים אחרים.
מבחינה סכמטית, האינטראקציה של אלנין עם נינהידרין עוקבת אחר אותו עיקרון. הוא מתחבר למגיב בקבוצת האמינים, ותחת פעולת יוני הידרוניום פעילים (H3O+) מתפצל בפחמן -קשר חנקן, מתפרק לאצטאלדהיד (CH3COH) ולפחמן דו חמצני (CO2). מולקולת נינהידרין נוספת מתחברת לחנקן, מחליפה מולקולות מים, ונוצר מבנה צובע (איור 4).
תגובה עם תרכובת אמינו הטרוציקלית
תגובת הנינהידרין עם פרולין היא ספציפית, במיוחד בניתוחים כרומטוגרפיים, מכיוון שמבנים כאלה במדיום חומצי מצהיבים תחילה, ולאחר מכן הופכים לסגולים בנייטרלי. החוקרים מסבירים זאת באמצעות תכונה של סידור מחדש של המחזור בתרכובת הביניים, המושפעת בדיוק מנוכחותם של מספר רב של פרוטוני מימן המשלימים את רמת האנרגיה החיצונית של חנקן.
הרס ההטרוציקל אינו מתרחש, ומולקולת נינהידרין נוספת מחוברת אליו באטום הפחמן הרביעי. לאחר חימום נוסף, המבנה שנוצר בתווך ניטרלי הופך לסגול רומן (איור 5).
הכנת המגיב הראשי
בדיקת נינהידרין מתבצעת עם תמיסות שונות, בהתאם לפירוק של מבני אמינו באורגנים מסוימיםתרכובות אנאורגניות.
המגיב העיקרי הוא הכנת תמיסה של 0.2% במים. זוהי תערובת רב-תכליתית, שכן רוב התרכובות מתמוססות היטב ב-H2O. כדי להשיג מגיב שהוכן טרי, דגימה של 0.2 גרם של נינהידרין טהור מבחינה כימית מדוללת ב-100 מ ל מים.
ראוי לציין שלחלק מהתמיסות המנותחות הריכוז הזה אינו מספיק, לכן ניתן להכין תמיסות של 1% או 2%. זה אופייני לתמציות מחומרי גלם רפואיים, מכיוון שהם מכילים סוגים שונים של תרכובות אמינו.
בעת ביצוע מחקרים כרומטוגרפיים, ניתן להכין תמיסות, למשל, בעת שטיפת תערובת על נשא מוצק דרך עמודה, באלכוהול, דימתיל סולפטוקסיד, אצטון וממיסים קוטביים אחרים - הכל יהיה תלוי בממס של מסוימים מבני אמינו.
Application
תגובת הנינהידרין מאפשרת לזהות תרכובות אמינו רבות בתמיסה, מה שהפך אותה לאחד הראשונים בשימוש בניתוח איכותי של חומרים אורגניים. קביעה חזותית מפחיתה משמעותית את מספר הניסויים, במיוחד כאשר מנתחים צמחים, תרופות וצורות מינון שנחקרו בצורה גרועה, כמו גם פתרונות ותערובות לא ידועים.
במדע משפטי, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לקבוע נוכחות של סימני זיעה על כל משטח.
גם למרות חוסר הספציפיות של התגובה, הנסיגה של תגובת הנינהדרין מהתרגול הכימי היא בלתי אפשרית, שכןהחלפת החומר הזה באנלוגים פחות רעילים (לדוגמה, אוקסולין) הוכיחה שיש להם רגישות נמוכה יותר לקבוצות אמינו ואינם נותנים תוצאות טובות בניתוחים פוטומטריים.
