ספיגה ופליטת אור חוזרת נוספת על ידי מדיה אנאורגנית ואורגנית היא תוצאה של זרחנית או פלואורסצנטיות. ההבדל בין התופעות הוא אורך המרווח בין קליטת האור לפליטת הנחל. עם הקרינה, תהליכים אלה מתרחשים כמעט בו-זמנית, ועם זרחן, באיחור מסוים.
רקע היסטורי
בשנת 1852, המדען הבריטי סטוקס תיאר לראשונה את הקרינה. הוא טבע את המונח החדש כתוצאה מהניסויים שלו עם פלואורספאר, שפלט אור אדום בחשיפה לאור אולטרה סגול. סטוקס ציין תופעה מעניינת. הוא גילה שאורך הגל של אור פלורסנט תמיד ארוך יותר מזה של אור העירור.
ניסויים רבים בוצעו במאה ה-19 כדי לאשש את ההשערה. הם הראו שמגוון דגימות זורחות כאשר הן נחשפות לאור אולטרה סגול. חומרים כללו, בין היתר, גבישים, שרפים, מינרלים, כלורופיל,חומרי גלם רפואיים, תרכובות אנאורגניות, ויטמינים, שמנים. השימוש הישיר בצבעים לניתוח ביולוגי החל רק בשנת 1930
תיאור מיקרוסקופ פלואורסצנטי
חלק מהחומרים ששימשו במחקר במחצית הראשונה של המאה ה-20 היו מאוד ספציפיים. הודות לאינדיקטורים שלא ניתן היה להשיג בשיטות ניגודיות, שיטת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הפכה לכלי חשוב הן במחקר הביו-רפואי והן במחקר הביולוגי. לתוצאות שהתקבלו הייתה חשיבות לא קטנה עבור מדעי החומרים.
מה הם היתרונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי? בעזרת חומרים חדשים, ניתן היה לבודד תאים ורכיבים תת-מיקרוסקופיים מאוד ספציפיים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר לך לזהות מולקולות בודדות. מגוון צבעים מאפשרים לזהות מספר אלמנטים בו זמנית. למרות שהרזולוציה המרחבית של הציוד מוגבלת על ידי מגבלת הדיפרקציה, אשר, בתורה, תלויה במאפיינים הספציפיים של הדגימה, גילוי מולקולות מתחת לרמה זו גם אפשרי בהחלט. דגימות שונות מציגות autofluorescence לאחר הקרנה. תופעה זו נמצאת בשימוש נרחב בתעשיית פטרולוגיה, בוטניקה, מוליכים למחצה.
תכונות
המחקר של רקמות בעלי חיים או מיקרואורגניזמים פתוגניים מסובך לעתים קרובות על ידי אוטופלואורסצנטי חלש מדי או חזק מאוד לא ספציפי. עם זאת, הערך בהמחקר רוכש את ההקדמה לחומר של רכיבים הנרגשים באורך גל מסוים ופולטים שטף אור בעוצמה הנדרשת. פלואורכרומים פועלים כצבעים המסוגלים להתקשר בעצמם למבנים (בלתי נראים או גלויים). יחד עם זאת, הם נבדלים בסלקטיביות גבוהה ביחס ליעדים ולתשואה קוונטית.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הפכה בשימוש נרחב עם הופעת הצבעים הטבעיים והסינטטיים. היו להם פרופילי עוצמת פליטה ועירור ספציפיים והם כוונו למטרות ביולוגיות ספציפיות.
זיהוי מולקולות בודדות
לעתים קרובות, בתנאים אידיאליים, אתה יכול לרשום את הזוהר של אלמנט בודד. לשם כך, בין היתר, יש צורך להבטיח רעש גלאי נמוך מספיק ורקע אופטי. מולקולת פלואורססאין יכולה לפלוט עד 300,000 פוטונים לפני הרס עקב הלבנת צילום. עם קצב איסוף של 20% ויעילות התהליך, ניתן לרשום אותם בסכום של כ-60 אלף
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המבוססת על פוטודיודות מפולת או כפל אלקטרונים, אפשרה לחוקרים לצפות בהתנהגות של מולקולות בודדות במשך שניות, ובמקרים מסוימים דקות.
Difficulties
בעיית המפתח היא דיכוי רעשים מהרקע האופטי. בשל העובדה שרבים מהחומרים המשמשים לבניית מסננים ועדשות מציגים פלורסנטיות מסוימת, מאמציהם של המדענים בשלבים הראשונים התמקדו בהנפקהרכיבים בעלי פלואורסצנטיות נמוכה. עם זאת, ניסויים שלאחר מכן הובילו למסקנות חדשות. בפרט, נמצא כי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המבוסס על השתקפות פנימית כוללת משיגה רקע נמוך ותפוקת אור עירור גבוהה.
מנגנון
העקרונות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המבוססת על השתקפות פנימית מוחלטת הם שימוש בגל מתפורר במהירות או שאינו מתפשט. היא נוצרת בממשק בין מדיה עם מדדי שבירה שונים. במקרה זה, קרן האור עוברת דרך פריזמה. יש לו מקדם שבירה גבוה.
הפריזמה צמודה לתמיסה מימית או לזכוכית עם פרמטר נמוך. אם אלומת האור מכוונת אליו בזווית גדולה מזו הקריטית, האלומה מוחזרת לחלוטין מהממשק. תופעה זו, בתורה, מולידה גל שאינו מתפשט. במילים אחרות, נוצר שדה אלקטרומגנטי החודר לתווך בעל מקדם שבירה נמוך יותר במרחק של פחות מ-200 ננומטר.
בגל שאינו מתפשט, עוצמת האור תהיה די מספקת כדי לעורר פלואורפורים. עם זאת, בשל עומקו הרדוד במיוחד, נפחו יהיה קטן מאוד. התוצאה היא רקע ברמה נמוכה.
שינוי
ניתן לממש מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המבוססת על השתקפות פנימית כוללת באמצעות אפי-תאורה.לשם כך נדרשות עדשות עם צמצם מספרי מוגדל (לפחות 1.4, אך רצוי שיגיע ל-1.45-1.6), וכן שדה מואר חלקית של המכשיר. זה האחרון מושג עם נקודה קטנה. לאחידות רבה יותר משתמשים בטבעת דקה שדרכה נחסם חלק מהזרימה. כדי להשיג זווית קריטית שאחריה מתרחשת השתקפות מוחלטת, יש צורך ברמת שבירה גבוהה של מדיום הטבילה בעדשות ובזכוכית הכיסוי של המיקרוסקופ.
