כתם גראם נמצא בשימוש נרחב במיקרוביולוגיה מכיוון שזו אחת הדרכים הקלות ביותר להבדיל בין חיידקים על סמך הרכב דופן התא שלהם. לפי גראם, ניתן לחלק את כל החיידקים לגרם חיובי (גרם (+)) וגרם שלילי (גרם (-)). שיטת כתמי הגראם פותחה בשנת 1884 ומאז לא איבדה פופולריות, אם כי שונתה מספר פעמים.
מבנה קיר התא
צביעת גראם מגלה אם חיידק הוא גראם חיובי או גראם שלילי. חלוקת החיידקים לגרם (+) וגרם (-) מתבצעת בהתאם למבנה דופן התא שלהם.
דופן התא מכילה את הכמות הגדולה ביותר של פפטידוגליקן (murein) - חומר מורכב, הכולל פפטאפפטיד וגליקן. הגליקן מורכב משאריות מתחלפות של N-acetylglucosamine וחומצה N-acetylmuramic המקושרים זה לזה על ידי β-1,4 קשרים גליקוזידים. Peptidoglycan מספק תחזוקה של צורת התא, הגנה אוסמטית ותפקודים אנטיגנים.
הבדלים עיקריים בין חיידקים גראם-חיוביים ו-גראם-שליליים
לחיידקים שונים יש עובי שכבת פפטידוגליקן שונה. בחיידקים המסווגים כ-גרם חיוביים הוא נע בין 15 ל-80 ננומטר, בעוד שבגרם שלילי הוא בין 2 ל-8 ננומטר. יחד עם זאת, לחיידקים גראם-שליליים יש מבנה מיוחד מתחת לשכבת הפפטידוגליקן, שאין לחיידקים גראם-חיוביים - החלל הפריפלסמי. חלל זה מלא באנזימים הידרוליטים - β-lactamase, ribonuclease 1, phosphatase. אנזימים אלו הם שאחראים לעמידותם של חיידקים גראם שליליים לאנטיביוטיקה רבות.
שכבת הפפטידוגליקן גראם(-) של חיידקים קשורה לליפופוליסכריד, מבנה אנטיגני המכיל אנדוטוקסין. בחיידקי גראם(+), חומצות טייכואיות ממלאות פונקציות דומות.
לחיידקים גראם-שליליים יש מבנה נוסף - הממברנה החיצונית.
מהות שיטת הצביעה
לפני שמתחילים לצבוע, מכינים מריחות של החיידקים שנחקרו. לשם כך, מטפטפים מים על שקופית זכוכית ומוסיפים שם תרבית של מיקרואורגניזמים עם לולאה חיידקית. לאחר מכן, לאחר שהמים התייבשו לחלוטין, המריחה מתקבעת - שקף הזכוכית נישא מספר פעמים מעל להבת המבער. צביעת גראם יעילה יותר מצביעת חיידקים חיים - מולקולות צבע נקשרות טוב יותר לתאים מתים.
הצביעה מתבצעת במספר שלבים:
- חתיכות קטנות של נייר סינון מונחות על מריחה קבועה ויוצקים את הצבע הראשי - סגול ג'נטיאן או מתילן כחול.
- לאחר 3-5 דקות, הסר את נייר הסינון הצבעוני ומלא את המריחה בתמיסת לוגול למשך דקה. במקרה זה, ההכנה מתכהה.
- תמיסת Lugol מרוקן והמריחה מטופלת באלכוהול אתילי טהור: מטפטפים כמה טיפות על התכשיר, מרוקנים לאחר 20 שניות. ההליך חוזר על עצמו 2-3 פעמים.
- שטוף את שקף הבדיקה במים מזוקקים.
- להפיק צביעה נוספת - לסיים את ההכנה עם פוקסין. לאחר 1-2 דקות, הצבע נשטף.
- לאחר שהמים מתייבשים, בדוק את המריחה במיקרוסקופ. חיידקים גראם חיוביים יהיו כחולים-סגולים, חיידקים גראם שליליים יהיו ורודים או אדומים.
סיבות לדפוסי צביעה שונים
כפי שתואר לעיל, צביעה גראם של חיידקים מכתימה חיידקים גראם חיוביים כחול-סגול, בעוד שחיידקים גראם שליליים צובעים אדום או ורוד. הסיבה לצביעה הדיפרנציאלית של חיידקים בשיטה זו היא שלאחר שהצורה המסיסה של סיגלית ג'נטיאן נכנסת לתא, הצבע עובר לצורת יוד בלתי מסיס. במהלך הטיפול בחיידקים באלכוהול אתילי, שומנים מופקים מהממברנה תחת פעולת הממס הלא קוטבי הזה. לאחר מכן, הממברנה הופכת לנקבוביות ואינה מהווה עוד מחסום משמעותי בפני שטיפת צבע. למרות זאתפפטידוגליקן עמיד יותר לממסים לא קוטביים, כולל אלכוהול. הוא זה שמונע את השטיפה מהצבע, אז חיידקים עם שכבת מוריין עבה הופכים לכחול-סגול (חיובי לגרם), ולאחר טיפול באלכוהול הם לא משנים את צבעם.
שכבה דקה של חיידקים גראם-שליליים לא יכולה להחזיק את מולקולות הצבע בתא, ולכן לאחר פעולת האלכוהול הן הופכות חסרות צבע - מכתימות גראם-שליליות.
לאחר חשיפה של מריחה לפוקסין, חיידקים מוכתמים בגראם נשארים כחולים-סגולים, בעוד שחיידקים גראם-שליליים הופכים לורוד-אדום.
דוגמאות לחיידקי Gram(+) ו-Gram(-)
חיידקים גראם-שליליים כוללים ציאנובקטריות, חיידקי גופרית, חיידקי ברזל, כלמידיה, ריקטסיה, חיידקי אצטית, מתילובקטריות רבות, חיידקים תיונים, ארסניטובקטריה, קרבוקסיבקטריה.
Bifidobacteria, חיידקי מים רבים, סטרפטוקוקים וסטפילוקוקים הם חיוביים גראם.
