מיקרואורגניזמים בטבע שסביבנו נמצאים בכל מקום: בקרקעות, במקווי מים, על פני השטח של עצמים שונים, אנשים ובעלי חיים מאוכלסים בהם. כל זה יכול לשמש מקורות לזיהום מיקרוביאלי של מזון, תרופות וקווי ייצור. גידול חיידקים הכרחי כדי ללמוד את תכונותיהם, הצרכים והמאפיינים שלהם. זהו, בתורו, שלב חשוב בפיתוח תרופות שונות, אבחון מחלות במעבדה, חישוב כורי ייצור ועוד ועוד.
מושגים כלליים
גידול חיידקים במיקרוביולוגיה מתייחס לגידול של מיקרואורגניזמים המתבצע במעבדה. בתורם, חיידקים שגדלו על מצע תזונתי נבחר נקראים תרבית. ניתן לערבב תרבויות אם הן נוצרות על ידי סוגים שונים של מיקרואורגניזמים, וטהורות אם הן מיוצגות רק על ידי סוג אחד של חיידקים.
אם תזונתירק תא אחד מונח בתווך, ומתקבלת קבוצת פרטים כתוצאה מהרבייה שלו, ואז קבוצה זו של מיקרואורגניזמים נקראת שיבוט. כאשר שיבוט מתפתח עד לנקודה שבה הוא הופך גלוי לעין בלתי מזוינת, אוסף חיידקים זה נקרא מושבה.
בדרך כלל גידול של חיידקים מבודדים ממקורות שונים מתבצע בנפרד זה מזה. כל קבוצה כזו שגדלה בנפרד של חיידקים נקראת זן. לכן, אם סוג אחד של סטפילוקוק מבודד משלושה מקורות (או מחלקים שונים של אותו מוצר, אנשים שונים), הם מדברים על שלושה זנים של סוג זה של סטפילוקוקוס.
גורמי גידול חיידקים
אלה כוללים חומצות אמינו שונות, שומנים, בסיסי פורין ותרכובות אחרות הנחוצות לפיתוח מיקרואורגניזמים. חיידקים מסוימים יכולים לייצר באופן עצמאי את החומרים הדרושים להם, בעוד שאחרים צריכים לקבל אותם בצורה מוגמרת. בהתאם לצרכים של מיקרואורגניזמים בגורמי גדילה מסוימים, מתבצע זיהוי והתמיינות של חיידקים. כמו כן, פרמטר זה חשוב להכנה נכונה של מדיום תזונתי לעבודות מעבדה וביוטכנולוגיות:
- חומצות אמינו. חיידקים עשויים לדרוש חומצת אמינו מסוימת אחת או קבוצת חומצות. אז, clostridia צריך לאוצין וטירוזין, סטרפטוקוקים צריכים לאוצין וארגינין. מיקרואורגניזמים שדורשים חומצות אמינו מבחוץ כדי לגדול נקראים אוקסוטרופים.
- בסיסי פורין ופירימידין, וכן נגזרותיהם (אדנין, גואנין ואחרים). הם גורם חשוב בצמיחה של רביםמיני סטרפטוקוקוס.
- ויטמינים. הם חלק מהקו-אנזימים הנדרשים על ידי חיידקים. אז, חומצה ניקוטינית, כמו גם האמיד שלה, שהם חלק מ-NAD ו-NADP, נחוצים על ידי דיפתריה ו-shigella corynebacteria. תיאמין, כחלק אינטגרלי של pyrophosphate, נדרש על ידי Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. חומצה פנטותנית, שהיא חלק מקו-אנזים CoA, נדרשת על ידי חיידקי טטנוס וסוגים מסוימים של סטרפטוקוקוס. ציטוכרומים, ולפיכך החומצה הפולית, ההמס והביוטין היוצרים אותם, נחוצים עבור Mycobacterium tuberculosis ו-Haemophilus influenzae.
דרישות הסביבה
תנאים לאמצעי תרבות להתרבות חיידקים:
- תזונה. הם חייבים להכיל חומרים, יתר על כן, בצורה קלה לעיכול, הנחוצים למיקרואורגניזמים להאכיל ולחדש אנרגיה. אלה כוללים אורגנוגנים ומינרלים. מיקרואורגניזמים מסוימים דורשים בנוסף ויטמינים וחומצות אמינו שהם לא יכולים לסנתז.
- רמת pH אופטימלית. הוא משפיע על חדירות קרום התא ובהתאם לכך על יכולת ספיגת חומרי הזנה על ידי החיידק. לרוב, ערך ה-pH צריך להיות ברמה של 7, 2-7, 4. מיקרואורגניזמים רבים במהלך חייהם מייצרים מוצרים בעלי תגובות חומציות או אלקליות, ועל מנת שה-pH של המדיום התזונתי לא ישתנה, זה חייב להיות מאוחסן.
- איזוטוני. הלחץ האוסמוטי בתווך התזונתי לגידול חיידקים צריך להיות בעל אותם ערכים כמובתוך תאים מיקרוביאליים. זה בדרך כלל מתאים לתמיסת 0.5% NaCl.
- סטריליות. זאת בשל העובדה שהופעת חיידקים זרים תעוות את תוצאות המחקר של הזן המנותח.
- רמת לחות. מחוון זה, יחד עם העקביות של המדיום, צריכים להיות בעלי מאפיינים אופטימליים עבור סוג מסוים של חיידקים.
- פוטנציאל Redox (RH2). הוא מציג את היחס בין החומרים התורמים ומקבלים אלקטרונים, כמו גם את רמת ריווי החמצן של המדיום התזונתי. עבור אירובים ואנאירובים, התנאים לטיפוח חיידקים שונים במקצת במדד זה. מיקרואורגניזמים אנאירוביים מתרבים בצורה הטובה ביותר בערכי RH2 מתחת ל-5 ומיקרואורגניזמים אירוביים לפחות 10.
- אחידות. חשוב שמצע התרבות יכיל כמויות קבועות של מרכיביו האישיים. בנוסף, עדיפים פתרונות ברורים, המקלים על מעקב אחר צמיחת היבול או זיהוי זיהום.
סוגי מדיה לתרבות
הבחירה במדיום מסוים לגידול מיקרואורגניזמים מושפעת מגורמים רבים, ביניהם מאפייני התזונה שלהם ומטרת המחקר. המאפיינים העיקריים העומדים בבסיס הסיווג של חומרי תזונה הם:
1. רכיבים. על פי החומרים הראשוניים המשמשים ליצירת המצע, הם מבחינים:
- טבעי, המוכנים ממוצרים ממקור מן החי או צמחי (למשל בשר, חלב, פירות) ומתאימים לגידול מעורביבולים;
- סינטטי למחצה, שבו מוצרי מזון טבעיים יקרים מוחלפים במוצרים שאינם מזון (לדוגמה, קמח עצמות, קרישי דם), ואשר הם אופטימליים לטיפוח סוגים מסוימים של חיידקים או לבידוד המוצרים המטבוליים שלהם. סביבה;
- סינטטי, המוכנים מכמויות מדויקות של תרכובות כימיות, בעלי הרכב קבוע ידוע וניתנים לשחזור בקלות.
2. עקביות (צפיפות). הבחנה בין סביבות:
- נוזל;
- צפוף;
- חצי נוזלי.
השניים האחרונים מוכנים מתמיסות מיוחדות או חומרים נוזליים בתוספת אגר-אגר או ג'לטין ליצירת הצפיפות הנדרשת. בנוסף, סביבה צפופה לגידול חיידקים היא סרום דם קרוש, תפוחי אדמה, מדיית סיליקה ג'ל, קרגינן.
3. מתחם. על בסיס זה, הסביבות הן:
- פשוט, הרשימה שלהם קצרה היא Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), ג'לטין מזין ומי פפטון.
- קומפלקס, מוכן מפשוטים בתוספת דם, מי גבינה, פחמימות וחומרים אחרים.
4. קביעת פגישה. המדיה התזונתית הבאה מובחנת:
- main משמשים לגידול חיידקים פתוגניים רבים (בדרך כלל הרכב פשוט);
- מיוחדים משמשים לבידוד ולטפח של חיידקים שאינם גדלים על מצעים פשוטים;
- סלקטיבי (הם גם סלקטיביים) מתאימים לבידוד סוג מסוים של חיידקים ומעכבים את הצמיחה של חיידקים קשורים (סלקטיביותנוצר על ידי הוספת חומרים מסוימים למדיה, כגון אנטיביוטיקה או מלחים, או על ידי התאמת ה-pH);
- אבחון דיפרנציאלי מאפשר להבחין בין סוג אחד של חיידקים לאחר על ידי הערכת הפעילות האנזימטית, למשל, של המדיום;
- יש צורך בחומרים משמרים עבור חיסון ראשוני עם הובלה של דגימות לאחר מכן, מכיוון שהם מונעים מוות של מיקרואורגניזמים, כמו גם מעכבים את הצמיחה של חיידקים אחרים.
הכנת מדיה
השלב החשוב ביותר בגידול חיידקים אנאירוביים הוא הכנת מצע תזונתי מתאים. לאחר בחירת הפרמטרים האופטימליים, המשך לשלבים הבאים:
- שקילה, על ידי בחירת מדגם של רכיבים במאזן אנליטי;
- המסה מתבצעת במים מזוקקים שחוממו ל-70 מעלות צלזיוס, ופוספטים, מיקרו- ומקרומלחים מומסים בנפרד;
- רותחים באמבט מים במשך שתי דקות;
- קביעת pH על ידי נייר מחוון או פוטנציומטר;
- סינון דרך בד רטוב או מסנני נייר עבור חומרים צפופים נוזליים כמו גם מותכים, ודרך מסנן כותנה גזה עבור מדיית אגר;
- ביקבוק בוצע בתפוסה של 3/4;
- עיקור תלוי בינוני;
- בקרת סטריליות מתבצעת על ידי התייצבות למשך יומיים בתרמוסטט, ולאחר מכן צפייה;
- בקרה כימית כדי לקבוע את ה-pH והתוכן של הדרושפריטים;
- בקרה ביולוגית על ידי חיסון ניסוי.
עיקור של כלי זכוכית ומדיה
אחד העקרונות הבסיסיים של גידול חיידקים הוא סטריליות. הצמיחה וההתפתחות של מיקרואורגניזמים זרים יכולים להשפיע על המאפיינים של המדיום התזונתי על ידי שינוי ההרכב הכימי וה-pH שלו. עיקור הוא התנאי העיקרי לגידול תרבויות טהורות. בפועל, מונח זה פירושו שיטות ההרס של כל צורות החיים על פני השטח ובנפח של חפצים מעוקרים. כלים, מכשירים בהם נעשה שימוש, אמצעי תקשורת ופריטים אחרים ששימשו במהלך המחקר עוברים עיקור.
סוגים מסוימים של עיקור:
- הצתה. עיקור של לולאות ומחטים לזריעה, שקופיות זכוכית, חלק מהמכשירים יכולים להתבצע באמצעות מבער או מנורת רוח.
- רותח. מתאים לטיפול במזרקים, מחטים, מזון, אך אינו הורג נבגי חיידקים.
- עיקור בחום יבש. הוא מתבצע בארון ייבוש מיוחד ומתאים לעיבוד צלוחיות, מבחנות וכלי זכוכית מעבדה אחרים.
- עיקור בקיטור. שיטה זו מבוצעת בחיטוי יעילה ביותר. אבל זה לא מתאים למדיה תזונתית המכילה חלבונים או כל תרכובות אחרות שמתפרקות בטמפרטורות גבוהות. חסך יותר יכול להיקרא tyndalization. הוא מתבצע בדוד קוך ומשלב את הנביטה של נבגים עם הרס שלהם.
- פסטור. הוא משמש עבור מדיה שמשנה את תכונותיהם בעת רתיחה (לדוגמה, חלב, יין, בירה), מסוגללפטור אותם ממיקרואורגניזמים שאינם נושאי נבגים. טמפרטורת העיבוד היא רק 50-60 מעלות צלזיוס למשך חמש עשרה עד שלושים דקות. במקרים מסוימים, נעשה שימוש בסטריליזציה קרה, המתבצעת באמצעות מסננים או קרני UV.
תנאי גידול חיידקים
הצמיחה וההתפתחות של חיידקים אפשרית רק תחת גורמים מסוימים והערכים של כל אחד מהם:
1. טֶמפֶּרָטוּרָה. ישנן שלוש קבוצות של חיידקים השונות בהעדפות טמפרטורה:
- תרמופילים, או חיידקים אוהבי חום, גדלים ב-45-90 מעלות צלזיוס, מה שאומר שהם אינם מתרבים באורגניזמים של בני אדם ובעלי חיים;
- פסיכופילים, או מיקרואורגניזמים אוהבי קור, מעדיפים טמפרטורות בטווח של 5-15 מעלות צלזיוס ומגודלים במחסני קירור;
- מזופילים, מתפתחים בטמפרטורה של 25-37 מעלות צלזיוס, הם כוללים את עיקר החיידקים.
2. אוֹר. זוהי תכונה של גידול חיידקים פוטוטרופיים, שכן הם מבצעים את התהליך הפוטוסינתטי. אבל עבור רוב החיידקים, תאורה אינה תנאי מוקדם. ואפילו להיפך, אולטרה סגול סולארי יכול לדכא את התפתחותם.
3. מים. כל המיקרואורגניזמים זקוקים למים בצורה נגישה (נוזלית). זו הסיבה שבמזון קפוא יש מעט או ללא גידול חיידקים.
4. חומציות של הסביבה. עקרון זה של טיפוח חיידקים כבר נדון בפירוט לעיל.
5. אִוְרוּר. חמצן, כיסוד כימי, הוא חלק בלתי נפרד מהמים ומספר לא מבוטל של תרכובות המשמשותגידול של מיקרואורגניזמים. חמצן גזי יכול להיות כלול גם במים ובנוזלים אחרים בצורה מומסת. חלק ניכר מהחיידקים זקוק לאספקה מתמדת של מולקולות חמצן. אבל עבור מספר מיקרואורגניזמים, זה מיותר, או, גרוע מכך, חמצן גזי רעיל להם, מכיוון שאין להם קטלאז ופרוקסידאז, אשר הורסים תוצרי נשימה רעילים. לכן, השלב החשוב ביותר בגידול של חיידקים אנאירוביים הוא הסרת מולקולות O2 מהמדיום התזונתי.
6. גידול של מיקרואורגניזמים. גידול חיידקים אירוביים ואנאירוביים מתבצע בשכבות שונות של הסביבה ובאופנים שונים.
טיפוח מיקרואורגניזמים אירוביים
טיפוח חיידקים אירוביים דורש חמצן מולקולרי. כדי להשיג תרבויות טהורות של אירובי שניתן להשתמש בהם בהצלחה ברפואה ובתעשיית המזון, נעשה שימוש בשיטות הבאות:
- משטח הגדל על מדיה צפופה או במדיה נוזלית (השכבה הדקה שלהם) כאשר חמצן מגיע ישירות מהאוויר;
- טיפוח עמוק במדיה נוזלית, כאשר עלייה בכמות החמצן המומס בהם מושגת על ידי אוורור מתמיד.
טיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים
העיקרון הבסיסי של טיפוח חיידקים מסוג זה הוא המגע המינימלי שלהם עם חמצן אטמוספרי. מתן תנאים לצמיחה שלהם הוא הרבה יותר קשה מאשר עבור אירובי. השיטות הבאות משמשות לבידוד אנאירובים מ-O2 מולקולרית:
- פיזי. שיטת גידול זו של חיידקים אנאירוביים מצטמצמת לגידולם במנגנון ואקום מיוחד - מיקרו-אנאירוסטאט. האוויר בו מוחלף בתערובת גז מיוחדת של חנקן בתוספת של 10% מימן ו-5% פחמן דו חמצני.
- כימיקל. אלה כוללים: שימוש בחומרים סופגים (למשל Fe, Na2S2O4, CuCl) או חומרים מפחיתים (כגון חומצה אסקורבית).
- ביולוגי. זה מסתכם בטיפוח משותף של אירובים ואנאירובים במערכת סגורה. שיטה זו של גידול חיידקים כוללת זריעת חצי אחד של צלחת פטרי עם חלק מהמינים האירוביים של חיידקים, והחצי השני עם האנאירובי הנחקר. הפיתוח שלו יתחיל ברגע שבו כל החמצן ייגמר.
שיטות הזריעה הבאות מתאימות לטיפוח חיידקים אנאירוביים:
- בשכבת פני השטח;
- בשכבת פני השטח המלאה בפרפין סטרילי;
- בעובי של מדיום מזין צפוף;
- בשכבות עמוקות של חומר צמיג.
השגת תרבות טהורה
מיקרוביולוגים בדרך כלל עובדים עם דגימות המאוכלסות בסוגים רבים ושונים של חיידקים. עם זאת, כדי לקבוע את המיקום השיטתי של מיקרואורגניזמים (משפחה, סוג, מינים), כמו גם ללמוד את המאפיינים שלהם, יש צורך לבודד אותם ולגדל תרבות טהורה. יש להם חשיבות רבה בתעשיות מזון רבות, למשל גבינה, לחם, קוואס, יין ועוד. גידול חיידקי חומצת חלב מאפשר להשיגמרכיב חיוני לייצור מוצרי חלב מותססים, בצק, קקאו, תחמיץ ואפילו פלסטיק.
השיטה של בידוד תרבית טהורה במדיום צפוף מבוססת על הפרדה מכנית של תאי מיקרואורגניזמים עם גידולם המבודד לאחר מכן. הדגימה מועברת לנפח סטרילי של מים או מי מלח (נפח 10-100 מ"ל) ולאחר מכן מנערים במשך שתי דקות. על מנת לחלץ מיקרואורגניזמים הנמצאים בעובי החומר הנבדק (לדוגמה, נקניקיות או גבינה), מבצעים תחילה שפשוף חלקי הדגימה עם מכשירים סטריליים בחול. החומר שעבר הכנה מקדימה, במשקל 1 גרם או נפח של 1 מ"ל, מדולל במים סטריליים פי 10, 100, 1000 וכו'. נבחרת דרגת הדילול שנותנת ריכוז תאים התואם ליכולות השיטה.
הגידול הבא של מיקרואורגניזמים הוא הכנת מצע תזונתי. בדרך כלל נבחר מדיום צפוף (MPA). תחילה ממיסים אותו ומצננים אותו ל-45-50 מעלות צלזיוס, ורק לאחר מכן יוצקים אותו למספר צלחות פטרי (שלוש עד חמש חתיכות), שעל תחתיתן מניחים ספוגיות מהחומר הנבדק בריכוזים שונים. לאחר מכן, מתבצע ערבוב של המדיום התזונתי שעדיין לא קפוא והחומר שהוכנס אליו. כך מקובעים תאים בנקודות שונות בנפח המצע.
לאחר מכן, צלחות פטרי ממוקמות בתרמוסטט למשך יומיים ב-22 מעלות צלזיוס. במהלך הזמן הזה, התאים מתרבים עד כדי כך שהמושבה שנוצרה על ידי כל אחד מהתאים הופכת גלויה לעין בלתי מזוינת. כל אחד מהם הוא תרבית טהורה של סוג החיידקים שמתואם הואעלה.
לאחר מכן, מצלחות פטרי, מיקרואורגניזמים עוברים תת-תרבות למבחנות נפרדות מלאות בתווך מזין. בדרך זו, תרבויות טהורות מבודדות מדגימה מעורבת. שיטה זו נושאת את שמו של מפתחה - ר' קוך. נהוג לקרוא לזה גם שיטת הכוס, או זריעה מדלדלת. לאחר השגת תרביות טהורות של סוגים שונים של חיידקים, נקבעים צורתם, הנבגים ומשפחותיהם.
כל העבודה חייבת להתבצע על פי עקרונות האספסיס. כדי למנוע התפתחות מוקדמת של מיקרואורגניזמים, המחקר צריך להתבצע מיד לאחר הדגימה. מי ברז מנותחים לאחר ניקוז המנות הראשונות, מכיוון שהם עשויים להכיל חיידקים שהצטברו בצינורות ובברזים. המיקרופלורה של פירות, פירות יער וירקות ממוקמת בעיקר על פני השטח (קליפה), ולכן מבוצעות ממנה שטיפות. לשם כך, הניחו את העובר במיכל סטרילי ומלאו אותו בכמות המים הנדרשת. ואז הם מנערים די נמרצות ואת המים מוזגים לתוך מיכל אחר. יבולים ממוצרי בד מתקבלים גם בספוגיות, אך לפני כן חותכים מהם חתיכות בגודל נתון.
