ישנן שיטות רבות ושונות לניתוח ההרכב וללימוד התכונות של תרכובות ותערובות חומרים שונים. שיטה אחת כזו היא כרומטוגרפיה. המחבר בהמצאה וביישום השיטה שייך לבוטנאי הרוסי מ.ס. צוות, שבתחילת המאה ה-20 ביצע הפרדת פיגמנטים צמחיים.
הגדרה והיסודות של השיטה
כרומטוגרפיה היא שיטה פיזיקוכימית להפרדת תערובות ולקביעת מרכיביהן, המבוססת על ההתפלגות בין השלב הנייד והנייח של החומרים המרכיבים את התערובת (מדגם). השלב הנייח הוא חומר מוצק נקבובי - חומר סופג. זה יכול להיות גם סרט נוזלי שהופקד על משטח מוצק. הפאזה הניידת - הספוג - חייב לנוע לאורך השלב הנייח או לזרום דרכו, תוך סינון על ידי הסורבנט.
מהות הכרומטוגרפיה היא שמרכיבים שונים של תערובת מאופיינים בהכרח בתכונות שונות, כמו משקל מולקולרי, מסיסות, יכולת ספיגה וכדומה. לכן, קצב האינטראקציה של מרכיבי הפאזה הניידת - סורבטים - עם הנייחזה לא אותו הדבר. זה מוביל להבדל במהירויות של מולקולות התערובת ביחס לשלב הנייח, וכתוצאה מכך הרכיבים מופרדים ומתרכזים באזורים שונים של הסורבנט. חלקם עוזבים את הסורבנט יחד עם הפאזה הניידת - אלו הם מה שנקרא רכיבים בלתי נשמרים.
יתרון מיוחד של כרומטוגרפיה הוא שהיא מאפשרת להפריד במהירות בין תערובות מורכבות של חומרים, כולל כאלה עם תכונות דומות.
שיטות לסיווג סוגי כרומטוגרפיה
ניתן לסווג את השיטות המשמשות בניתוח לפי קריטריונים שונים. הסט העיקרי של קריטריונים כאלה הוא כדלקמן:
- מצב מצטבר של שלבים נייחים וניידים;
- טבע הפיזי והכימי של האינטראקציה בין הסורבנט והסורבטים;
- איך להציג eluent ולהזיז אותו;
- שיטת המיקום של השלב הנייח, כלומר טכניקת כרומטוגרפיה;
- יעדי כרומטוגרפיה.
בנוסף, שיטות יכולות להתבסס על האופי השונה של תהליך הספיגה, על התנאים הטכניים של ההפרדה הכרומטוגרפית (לדוגמה, לחץ נמוך או גבוה).
בואו נסקור מקרוב את הקריטריונים העיקריים שלעיל ואת סוגי הכרומטוגרפיה הנפוצים ביותר הקשורים אליהם.
מצב צבירה ספוג וסופג
על בסיס זה, הכרומטוגרפיה מחולקת לנוזל וגז. שמות השיטה משקפים את מצב השלב הנייד.
כרומטוגרפיה נוזלית היא טכניקה בשימושבתהליכי הפרדת תערובות של תרכובות מקרומולקולריות, כולל תרכובות חשובות מבחינה ביולוגית. בהתאם למצב הצבירה של הסורבנט, הוא מחולק לפאזה נוזלית-נוזלית ולפאזה נוזלית-מוצקת.
כרומטוגרפיית גז היא מהסוגים הבאים:
- ספיחת גז (פאזה מוצק-גז), המשתמשת בחומר סופג מוצק, כגון פחם, סיליקה ג'ל, זאוליטים או פולימרים נקבוביים. גז אינרטי (ארגון, הליום), חנקן, פחמן דו-חמצני פועל כחומר eluent - נשא של התערובת שיש להפריד. ההפרדה של הרכיבים הנדיפים של התערובת מתבצעת עקב דרגת הספיחת השונה שלהם.
- גז-נוזל. השלב הנייח במקרה זה מורכב מסרט נוזלי המופקד על בסיס אינרטי מוצק. רכיבי דוגמה מופרדים לפי יכולת הספיגה או המסיסות שלהם.
כרומטוגרפיה גז נמצאת בשימוש נרחב לניתוח תערובות של תרכובות אורגניות (באמצעות תוצרי הפירוק שלהן או נגזרות שלהן בצורת גז).
אינטראקציה בין סורבנט לסורבטים
לפי קריטריון זה, סוגים כאלה מובחנים כמו:
- כרומטוגרפיה ספיחה, שדרכה מופרדות תערובות עקב הבדלים בדרגת ספיחה של חומרים על ידי חומר ספיגה בלתי נייד.
- הפצה. בעזרתו, ההפרדה מתבצעת על בסיס מסיסות שונה של מרכיבי התערובת. התמוססות מתרחשת בשלב הנייד והנייח (בכרומטוגרפיה נוזלית), או רק בשלב הנייח (בגז-נוזלכרומטוגרפיה).
- משקעים. שיטת כרומטוגרפיה זו מבוססת על מסיסות שונה של המשקעים שנוצרו של החומרים להפרדה.
- אי הכללה, או כרומטוגרפיה של ג'ל. הוא מבוסס על ההבדל בגודל של מולקולות, שבגללו משתנה יכולתן לחדור לנקבוביות הסורבנט, מה שנקרא מטריצת ג'ל.
- Affine. שיטה ספציפית זו, המבוססת על סוג מיוחד של אינטראקציה ביוכימית של זיהומים מופרדים עם ליגנד היוצר תרכובת מורכבת עם נשא אינרטי בשלב הנייח. שיטה זו יעילה בהפרדת תערובות של חלבון-אנזימים והיא נפוצה בביוכימיה.
- חילופי יונים. כגורם הפרדת דגימות, שיטה זו משתמשת בהבדל ביכולת של מרכיבי התערובת להחליף יונים עם הפאזה הנייח (מחלף יונים). במהלך התהליך, יונים של הפאזה הנייחת מוחלפים ביונים של חומרים בהרכב הפלטה, בעוד שבגלל הזיקה השונה של האחרון למחליף היונים נוצר הבדל במהירות תנועתם, וכך תערובת מופרדת. לשלב הנייח, משתמשים לרוב בשרף חילופי יונים - פולימרים סינתטיים מיוחדים.
לכרומטוגרפיה של חילופי יונים יש שתי אפשרויות - אניוני (שומר על יונים שליליים) וקטיוניים (שומר על יונים חיוביים, בהתאמה). שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב ביותר: בהפרדת אלקטרוליטים, יסודות אדמה נדירים וטרנסאורניום, בטיהור מים, בניתוח תרופות.
ההבדל בשיטות הטכניקה
ישנן שתי דרכים עיקריות שבהן המדגם נע ביחס לשלב הנייח:
- כרומטוגרפיה עמודה מבצעת את תהליך ההפרדה במכשיר מיוחד - עמודה כרומטוגרפית - צינורית, שבחלל הפנימי שלה מונח סורבנט בלתי ניתן להזזה. על פי שיטת המילוי, העמודים מחולקים לשני סוגים: ארוזים (מה שנקרא "ארוזים") וקפילאריים, שבהם מונחת על פני השטח של חומר סופג מוצק או סרט נוזלי מהשלב הנייח. הקיר הפנימי. לעמודים ארוזים יכולים להיות צורות שונות: ישר, בצורת U, ספירלה. עמודים נימיים הם סליליים.
- כרומטוגרפיה מישורית (מישורית). במקרה זה, ניתן להשתמש בנייר מיוחד או צלחת (מתכת, זכוכית או פלסטיק) כמנשא לשלב הנייח, שעליו מונחת שכבה דקה של חומר סופג. במקרה זה, שיטת הכרומטוגרפיה מכונה כרומטוגרפיה נייר או שכבה דקה, בהתאמה.
בניגוד לשיטת העמודות, שבה נעשה שימוש חוזר בעמודות כרומטוגרפיות, בכרומטוגרפיה מישורית, ניתן להשתמש בכל מנשא עם שכבת סופגת פעם אחת בלבד. תהליך ההפרדה מתרחש כאשר צלחת או גיליון נייר טובלים במיכל עם חומר eluent.
הקדמה והעברה של eluent
גורם זה קובע את אופי התנועה של האזורים הכרומטוגרפיים לאורך שכבת הספיגה, הנוצרים במהלך הפרדת התערובת. יש את שיטות המסירה הבאות:
- חזית. שיטה זו היא הפשוטה ביותרטכניקת ביצוע. השלב הנייד הוא ישירות הדגימה עצמה, המוזנת ברציפות לעמודה המלאה בסופג. במקרה זה, הרכיב הפחות נשמר, נספג גרוע יותר מאחרים, נע לאורך הסורבנט מהר יותר מהאחרים. כתוצאה מכך, ניתן לבודד רק את הרכיב הראשון הזה בצורה טהורה, ואחריו אזורים המכילים תערובות של רכיבים. התפלגות המדגם נראית כך: א; א+ב; A+B+C וכן הלאה. לכן כרומטוגרפיה פרונטלית אינה שימושית להפרדת תערובות, אך היא יעילה בתהליכי טיהור שונים, בתנאי שלחומר המיועד לבודד יש שמירה נמוכה.
- שיטת העקירה נבדלת בכך שלאחר הכניסה לתערובת המיועדת להפרדה, מוזן אל העמוד ספוג עם מחליף מיוחד - חומר המאופיין ביכולת ספיגה גדולה יותר מכל מרכיבי התערובת. הוא מחליף את הרכיב השמור ביותר, אשר מחליף את הרכיב הבא, וכן הלאה. המדגם נע לאורך העמוד במהירות העקירה ויוצרת אזורי ריכוז סמוכים. עם סוג זה של כרומטוגרפיה, ניתן להשיג כל רכיב בנפרד בצורה נוזלית במוצא העמוד.
- שיטת ה-eluent (הפיתוח) היא הנפוצה ביותר. בניגוד לשיטת העקירה, למפלט (הנשא) במקרה זה יכולת ספיגה נמוכה יותר ממרכיבי הדגימה. זה מועבר ברציפות דרך שכבת הספיגה, שוטף אותו. מעת לעת, במנות (פולסים), התערובת שיש להפריד מוכנסת לזרם המנקה, ולאחר מכן הזנת שוב את המסיר הטהור. בעת שטיפה החוצה (פליטה), הרכיבים מופרדים,יתר על כן, אזורי הריכוז שלהם מופרדים על ידי אזורי eluent.
כרומטוגרפיה של eluent מאפשרת להפריד כמעט לחלוטין את תערובת החומרים המנותחת, והתערובת יכולה להיות מרובה רכיבים. כמו כן, היתרונות של שיטה זו הם בידוד הרכיבים זה מזה ופשטות הניתוח הכמותי של התערובת. החסרונות כוללים צריכה גבוהה של eluent וריכוז נמוך של רכיבי דגימה בו לאחר הפרדה ביציאת העמוד. שיטת הפלואנט נמצאת בשימוש נרחב הן בכרומטוגרפיית גז והן בכרומטוגרפיה של נוזלים.
תהליכים כרומטוגרפיים בהתאם למטרות
ההבדל ביעדי הכרומטוגרפיה מאפשר להבחין בשיטות כמו אנליטיות, הכנות ותעשייתיות.
באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית, מתבצע ניתוח איכותי וכמותי של תערובות. כאשר מנתחים את מרכיבי הדגימה, ביציאה מהעמודה של הכרומטוגרף, הם עוברים לגלאי - מכשיר רגיש לשינויים בריכוז חומר במפלט. הזמן שחלף מרגע הכנסת הדגימה לעמוד ועד לריכוז השיא המרבי של החומר על הגלאי נקרא זמן ההחזקה. בתנאי שטמפרטורת העמודה וקצב ההפלטה קבועים, ערך זה קבוע עבור כל חומר ומשמש בסיס לניתוח איכותי של התערובת. ניתוח כמותי מתבצע על ידי מדידת השטח של פסגות בודדות בכרומטוגרמה. ככלל, נעשה שימוש בשיטת ה-eluent בכרומטוגרפיה אנליטית.
כרומטוגרפיה הכנה מטרתה לבודד חומרים טהורים מתערובת. עמודות הכנה יש הרבה יותר גדולקוטר מאשר אנליטי.
כרומטוגרפיה תעשייתית משמשת, ראשית, כדי להשיג כמויות גדולות של חומרים טהורים הדרושים לייצור מסוים. שנית, זהו חלק חשוב ממערכות בקרה וויסות מודרניות לתהליכים טכנולוגיים.
לכרומטוגרף תעשייתי יש סולם ריכוז של רכיב כזה או אחר והוא מצויד בחיישן, כמו גם מערכות בקרה ורישום. דגימות מועברות לכרומטוגרפים כאלה באופן אוטומטי בתדירות מסוימת.
ציוד כרומטוגרפיה רב תכליתי
כרומטוגרפים מודרניים הם מכשירי היי-טק מורכבים המסוגלים לשמש במגוון תחומים ולמטרות שונות. מכשירים אלה מאפשרים לנתח תערובות מורכבות מרובי רכיבים. הם מצוידים במגוון רחב של גלאים: מוליך תרמי, אופטי, יינון, ספקטרומטרי מסה וכן הלאה.
בנוסף, הכרומטוגרפיה המודרנית משתמשת במערכות בקרה אוטומטיות לניתוח ועיבוד של כרומטוגרמות. ניתן לבצע שליטה ממחשב או ישירות מהמכשיר.
דוגמה למכשיר כזה הוא כרומטוגרף הגז הרב-תכליתי "Crystal 5000". יש לו סט של ארבעה גלאים להחלפה, תרמוסטט עמודה, מערכות בקרת לחץ וזרימה אלקטרוניות ובקרות שסתומי גז. כדי לפתור בעיות שונות, יש למכשירהיכולת להתקין גם עמודות ארוזות וגם עמודות נימיות.
הכרומטוגרף נשלט באמצעות מקלדת ותצוגת שליטה מלאה או (בשינוי אחר) ממחשב אישי. ניתן להשתמש במכשיר מהדור החדש הזה ביעילות בייצור ובמעבדות מחקר שונות: רפואיות, משפטיות, סביבתיות.
כרומטוגרפיה בלחץ גבוה
ביצוע כרומטוגרפיה של עמודת נוזלים מאופיין באורך די ארוך של התהליך. כדי להאיץ את התנועה של eluent נוזלי, אספקת הפאזה הנייד לעמוד בלחץ משמש. שיטה מודרנית ומבטיחה מאוד זו נקראת שיטת כרומטוגרפיה נוזלית גבוהה (HPLC).
מערכת השאיבה של כרומטוגרף הנוזל של HPLC מספקת חומר eluent בקצב קבוע. לחץ הכניסה המפותח יכול להגיע ל-40 MPa. בקרת מחשב מאפשרת לשנות את הרכב הפאזה הניידת בהתאם לתוכנית נתונה (שיטת elution זו נקראת gradient).
HPLC ניתן להשתמש בשיטות שונות המבוססות על אופי האינטראקציה של הסורבנט והסורבט: הפצה, ספיחה, אי הכללת גודל, כרומטוגרפיה של חילופי יונים. הסוג הנפוץ ביותר של HPLC הוא שיטת ה-Reversed Phase, המבוססת על אינטראקציה הידרופוביה של פאזה ניידת קוטבית (מימית) וחומר סופג לא קוטבי, כגון סיליקה ג'ל.
השיטה נמצאת בשימוש נרחב להפרדה, ניתוח,בקרת איכות של חומרים לא נדיפים, לא יציבים מבחינה תרמית, שאינם ניתנים להמרה למצב גזי. אלו הם כימיקלים חקלאיים, תרופות, רכיבי מזון וחומרים מורכבים אחרים.
החשיבות של לימודי כרומטוגרפיה
סוגים שונים של כרומטוגרפיה נמצאים בשימוש נרחב בתחומים שונים:
- כימיה לא אורגנית;
- פטרוכימיקלים וכרייה;
- ביוכימיה;
- רפואה ותרופות;
- תעשיית המזון;
- ecology;
- קרימינולוגיה.
רשימה זו אינה שלמה, אך משקפת את הכיסוי של תעשיות שאינן יכולות להסתדר בלי שיטות כרומטוגרפיות של ניתוח, הפרדה וטיהור של חומרים. בכל תחומי היישום של הכרומטוגרפיה, ממעבדות מדעיות ועד לייצור תעשייתי, תפקידן של שיטות אלו הולך וגדל עוד יותר ככל שמוצגות טכנולוגיות מודרניות לעיבוד מידע, ניהול ובקרה של תהליכים מורכבים.
