שיטות מחקר ביולוגי מולקולרי ממלאות תפקיד גדול ברפואה המודרנית, משפטית וביולוגיה. הודות להתקדמות בחקר ה-DNA וה-RNA, אדם מסוגל לחקור את הגנום של אורגניזם, לקבוע את הגורם הגורם למחלה, לזהות את חומצת הגרעין הרצויה בתערובת של חומצות וכו'.
שיטות מחקר ביולוגי מולקולרי. מה זה?
בשנות ה-70 וה-80, מדענים הצליחו לראשונה לפענח את הגנום האנושי. אירוע זה נתן תנופה לפיתוח הנדסה גנטית וביולוגיה מולקולרית. חקר תכונות ה-DNA וה-RNA הוביל לכך שכיום ניתן להשתמש בחומצות גרעין אלו על מנת לאבחן מחלה, לחקור גנים.
השגת DNA ו-RNA
שיטות אבחון ביולוגיות מולקולריות דורשות נוכחות של חומר מוצא: לעתים קרובות יותר מדובר בחומצות גרעין. ישנן מספר דרכים לבודד חומרים אלו מתאי יצורים חיים. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות משלו, וזה הכרחילקחת בחשבון בעת בחירת שיטה לבידוד חומצות גרעין טהורות.
1. השגת DNA לפי מרמור. השיטה מורכבת מטיפול בתערובת של חומרים עם אלכוהול, וכתוצאה מכך משקע DNA טהור. החיסרון בשיטה זו הוא שימוש בחומרים אגרסיביים: פנול וכלורופורם.
2. בידוד DNA לפי בום. החומר העיקרי המשמש כאן הוא guanidine thiocyanate (GuSCN). זה תורם למשקעים של חומצה דאוקסיריבונוקלאית על מצעים מיוחדים, שמהם ניתן לאסוף אותה לאחר מכן באמצעות חיץ מיוחד. עם זאת, GuSCN הוא מעכב של PTC, ואפילו חלק קטן ממנו שנכנס ל-DNA המשוקע יכול להשפיע על מהלך תגובת השרשרת הפולימראזית, אשר ממלאת תפקיד חשוב בעבודה עם חומצות גרעין.
3. שקיעה של זיהומים. השיטה שונה מהקודמות בכך שלא המולקולות של החומצה הדאוקסיריבונוקלאית משוקעות, אלא זיהומים. לשם כך, משתמשים במחליפים יונים. החיסרון הוא שלא כל החומרים יכולים לזרז.
4. הקרנה המונית. שיטה זו משמשת במקרים בהם אין צורך במידע מדויק על הרכב מולקולת ה-DNA, אך יש צורך להשיג כמה נתונים סטטיסטיים. זה מוסבר על ידי העובדה שמבנה חומצת הגרעין עלול להינזק כאשר מטופלים בחומרי ניקוי, במיוחד אלקליות.
סיווג שיטות מחקר
כל שיטות המחקר הביולוגי המולקולרי מחולקות לשלוש קבוצות גדולות:
1. הגברה (באמצעות אנזימים רבים). כאןמתייחס ל-PCR - תגובת שרשרת פולימראז, אשר משחקת תפקיד גדול ברבות משיטות האבחון.
2. לא מגביר. קבוצת שיטות זו קשורה ישירות לפעולת תערובות של חומצות גרעין. דוגמאות הן 3 כתמים, הכלאה באתרו וכו'.
3. שיטות המבוססות על זיהוי אות ממולקולת בדיקה הנקשרת ל-DNA או RNA בדיקה ספציפיים. דוגמה לכך היא מערכת לכידה היברידית (hc2).
אנזימים שניתן להשתמש בהם בשיטות מחקר ביולוגיה מולקולרית
שיטות אבחון מולקולריות רבות כוללות שימוש במגוון רחב של אנזימים. להלן הנפוצים ביותר:
1. אנזים הגבלה - "חותך" את מולקולת ה-DNA לחלקים הדרושים.
2. DNA פולימראז - מסנתז מולקולה דו-גדילית של חומצה דאוקסיריבונוקלאית.
3. Transcriptase הפוך (revertase) - משמש לסינתזה של DNA על תבנית RNA.
4. DNA ligase - אחראי על יצירת קשרי פוספודיסטר בין נוקלאוטידים.
5. Exonuclease - מסיר נוקלאוטידים מהמקטעים הסופיים של מולקולת החומצה ה-deoxyribonucleic.
PCR היא השיטה העיקרית להגברת DNA
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) נמצאת בשימוש פעיל בביולוגיה מולקולרית מודרנית. זוהי שיטה שבה ניתן להשיג מספר עצום של עותקים ממולקולת DNA בודדת (מולקולות מוגברות).
פונקציות עיקריות של PCR:
- אבחוןמחלות;
- שיבוט של מקטעי DNA, גנים.
האלמנטים הבאים נדרשים לביצוע תגובת שרשרת פולימראז: מולקולת ה-DNA הראשונית, פולימראז DNA יציב תרמי (Taq או Pfu), פוספטים דאוקסיריבונוקלאוטידים (מקורות לבסיסים חנקניים), פריימרים (2 פריימרים לכל מולקולת DNA אחת).) ומערכת החוצץ עצמה, שבה כל התגובות אפשריות.
PCR מורכב משלושה שלבים: דנטורציה, חישול פריימר והתארכות.
1. דנטורציה. בטמפרטורה של 94-95 מעלות צלזיוס, קשרי המימן בין שני גדילי ה-DNA נשברים, וכתוצאה מכך נקבל שתי מולקולות חד-גדיליות.
2. חישול פריימר. בטמפרטורה של 50-60 מעלות צלזיוס, פריימרים מחוברים לקצוות של מולקולות חומצת גרעין חד-גדילית לפי סוג המשלימות.
3. הַאֲרָכָה. בטמפרטורה של 72 מעלות מתרחשת סינתזה של מולקולות בת דו-גדיליות של חומצה דאוקסיריבונוקלאית.
רצף DNA
שיטות מחקר ביולוגי מולקולרי דורשות לעתים קרובות ידע על רצף הנוקלאוטידים במולקולת חומצה דאוקסיריבונוקלאית. רצף מתבצע כדי לקבוע את הקוד הגנטי. אבחון מולקולרי של העתיד יתבסס על ידע שנרכש מרצף אנושי.
ניתן להבחין בין סוגי הרצף הבאים:
- רצף מקסאם-גילברט;
- סנג'ר רצף;
- pyrosequencing;
- nanoporeרצף.
