מה עומד בבסיס הכלאה של DNA? למרות שרצף ה-DNA הדו-גדילי יציב בדרך כלל בתנאים פיזיולוגיים, שינוי תנאים אלו במעבדה (בדרך כלל על ידי העלאת טמפרטורת הסביבה) יגרום למולקולות להיפרד לגדילים בודדים. האחרונים משלימים זה את זה, אך עשויים גם להשלים רצפים אחרים הקיימים בסביבתם. הורדת טמפרטורת הסביבה מאפשרת למולקולות החד-גדיליות להתחשל או "להכליד" זו עם זו. זוהי שיטת הכלאה של DNA.
המושג מנקודת מבט של ביולוגיה מולקולרית
מדענים המעורבים הן בשכפול ה-DNA והן בתעתוק ה-DNA ל-RNA מסתמכים על הצלבות נוקלאוטידים וטכניקות ביולוגיה מולקולרית. זה כולל כתם דרום וצפון, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ורוב גישות ההכלאה והרצף של DNA-RNA.
Application
הכלאה היא המאפיין העיקרי של נוקלאוטידרצפים ומשמש בשיטות רבות של ביולוגיה מולקולרית. ניתן לקבוע את הקשר הגנטי הכולל של שני מינים על ידי הכלאה של מקטעים של ה-DNA שלהם (הכלאה של DNA-DNA). עקב קווי דמיון בין אורגניזמים קרובים, נדרשת טמפרטורה גבוהה יותר כדי להמיס כלאיים מסוג DNA בהשוואה לאורגניזמים מרוחקים יותר. שיטות שונות משתמשות בהכלאה כדי לקבוע את המקור של דגימת DNA, כולל תגובת שרשרת הפולימראז (PCR). בשיטה אחרת, רצפי DNA קצרים עוברים הכלאה ל-mRNA תאי כדי לזהות גנים מבוטאים. חברות תרופות בודקות את השימוש ב-RNA antisense כדי להיקשר ל-mRNA לא רצוי, ומונעות מהריבוזום לתרגם mRNA לחלבון.
הכלאה של DNA-DNA מתייחסת בדרך כלל לטכניקה של ביולוגיה מולקולרית המודדת את מידת הדמיון הגנטי בין מאגרי רצפי DNA. זה משמש בדרך כלל כדי לקבוע את המרחק הגנטי בין שני אורגניזמים. נעשה בו שימוש נרחב בפילוגניה ובטקסונומיה.
מתודולוגיה
DNA מאורגניזם אחד סומן, ואז מעורבב עם DNA לא מסומן שניתן היה להשוות אליו. התערובת מודגרת כדי לאפשר לגדילי ה-DNA להתנתק ולאחר מכן להתקרר ליצירת DNA היברידי כפול גדילי מחודש. רצפים כלאיים בעלי רמה גבוהה של דמיון ייקשרו חזק יותר וידרשו יותר אנרגיה כדי להפריד ביניהם: כלומר, הם נפרדים כאשר מתחממים בחום גבוה יותר.טמפרטורה מאשר רצפים לא דומים, תהליך המכונה "המסת DNA".
המסת DNA
הערכת פרופיל ההיתוך של ה-DNA המוכלא, ה-DNA הדו-גדילי נקשר למה שנקרא "עמודה" והתערובת המתקבלת מחוממת. בכל שלב, העמוד נשטף ורצפי ה-DNA שנמסים הופכים לגדילים בודדים ונשטפים מהעמוד. הטמפרטורות שבהן ה-DNA המסומן יוצא מהעמודה משקפות את מידת הדמיון בין הרצפים (ודפוס הקיפול העצמי משמש בקרה). תוצאות אלו משולבות כדי לקבוע את מידת הדמיון הגנטי בין אורגניזמים. לפי המיקרוביולוגיה המודרנית, הכלאה של DNA בלתי אפשרית בלי להבין את הדברים האלה.
כאשר משווים בדרך זו מספר מיני חומצה ריבונוקלאית (או דיאוקסיריבונוקלאית), ערכי הדמיון מאפשרים למקם את המינים בעץ הפילוגנטי. לכן, זו אחת הגישות האפשריות לנהל שיטתיות מולקולרית. צ'ארלס סיבלי וג'ון אלקוויסט, החלוצים של טכניקה זו, השתמשו בהכלאה של DNA-DNA כדי לחקור את היחסים הפילוגנטיים של ציפורים (טקסונומיה של סיבלי-אהלקוויסט) ופרימטים.
חשיבות לביולוגיה
הכלאה של DNA-DNA היא תקן הזהב להבחנה בין מיני חיידקים, עם ערך דמיון של יותר מ-70%, מה שמעיד על כך שהזנים שהשוו שייכים למינים שונים. בשנת 2014, הוצע סף של 79% דמיון להפרדת תת-מין חיידקי.
המבקרים טוענים שהטכניקה אינה מדויקת להשוואת מינים קרובים, שכן כל ניסיון למדוד הבדלים בין רצפים אורתולוגיים בין אורגניזמים מוצף על ידי הכלאה של מקבילים פרלוגיים בגנום של אורגניזם. רצף DNA והשוואות רצף חישוביות הן כיום השיטה הנפוצה לקביעת מרחק גנטי, אם כי גישה זו עדיין משמשת במיקרוביולוגיה כדי לסייע בזיהוי חיידקים.
הדרך הנוכחית היא לבצע הכלאה של DNA-DNA בסיליקון באמצעות גנומים ברצף מלא או חלקי. ה-GGDC שפותח על ידי DSMZ הוא הכלי הידוע המדויק ביותר לחישוב ערכים דמויי DDH. בין שאר השיפורים האלגוריתמיים, הוא פותר את הבעיה עם רצפים פרלוגיים על ידי סינון קפדני שלהם מתוך התאמות בין שני רצפי גנום.
שיטת FISH
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) היא טכניקת מעבדה המשמשת לאיתור ורצף DNA, לעתים קרובות על כרומוזום ספציפי.
בשנת 1969, ג'וזף גאל ומרי לו פארדו פרסמו מאמר המדגים שניתן להשתמש בעותקים רדיואקטיביים של רצף DNA ריבוזמלי כדי לזהות רצפי DNA משלימים בגרעין של ביצת צפרדע. מאז התצפיות המקוריות הללו, חידודים רבים הגדילו את הרבגוניות והרגישות של ההליך עד כדי כך שהכלאה באתרו ("במקום", לטינית) נחשבת כיום לכלי חשוב בציטוגנטיקה. (המונח in situ משמש כיום גם להתייחסות לשלב הראשוני של צמיחת קרצינומה, כאשר רק רקמת אפיתל מעורבת בתהליך הפתולוגי.)
רצף הכלאה פלואורסצנטי
בדיקות RNA יכולות להיות מתוכננות עבור כל גן או כל רצף בתוך גן כדי להמחיש lncRNA ו-miRNA mRNA ברקמות ובתאים. FISH משמש על ידי חקר מחזור רביית התאים, בפרט שלב אינטרפאז גרעיני עבור כל הפרעות כרומוזומליות. FISH מאפשר לך לנתח סדרה גדולה של מקרים ארכיוניים, הרבה יותר קל לזהות את הכרומוזום שזוהה על ידי יצירת בדיקה עם בסיס כרומוזומים מלאכותי שימשוך כרומוזומים דומים.
אותות הכלאה עבור כל בדיקה כאשר מתגלה חריגה גרעינית: כל בדיקה לגילוי mRNA ו-lncRNA מורכבת מ-20 זוגות של אוליגונוקלאוטידים, כל זוג מכסה רווח של 40-50 bp. עמ. בדיקות משתמשות בכימיה קניינית כדי לזהות mRNA.
הכלאה עם בדיקות DNA
בדיקות עשויות לעתים קרובות מקטעי DNA אשר בודדו, טוהרו והוגברו לשימוש בעיצוב הגנום האנושי. גודלו של הגנום האנושי כה גדול בהשוואה לאורכו שניתן לרצף ישירות עד שיש צורך לחלקו לשברים. בסופו של דבר, הפרגמנטים הללו סומנו על ידי עיכול עותק של כל פרגמנט ליחידות קטנות עוד יותר באמצעות אנדונוקלאזים ספציפיים לרצף כדי למדוד את הגודל של כל פרגמנט קטן באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל תוך שימוש במידע זה כדי לקבוע היכן פרגמנטים גדולים חופפים זה לזה..
כדי לשמר את היסודות עם רצפי ה-DNA האישיים שלהם, השברים נוספו למערכת של אוכלוסיות חיידקים שחוזרות על עצמן. אוכלוסיות שיבוטים של חיידקים, שכל אוכלוסייה שומרת על כרומוזום מלאכותי בודד, מאוחסנות במעבדות שונות ברחבי העולם. כרומוזומים מלאכותיים (BACs) ניתן לגדל, לחלץ ולתייג בכל מעבדה המכילה ספרייה. ספריות גנומיות נקראות לרוב על שם המוסדות שבהם פותחו. דוגמה לכך היא ספריית RPCI-11, הנקראת על שם המכון לסרטן רוזוול בבפאלו (ניו יורק, ארה ב). שברים אלו מהווים כ-100 אלף זוגות בסיסים והם הבסיס לרוב בדיקות ה-FISH.
