חלבון הוא מרכיב חיוני בכל האורגניזמים. כל אחת מהמולקולות שלה מורכבת משרשרת פוליפפטיד אחת או יותר המורכבת מחומצות אמינו. למרות שהמידע הדרוש לחיים מקודד ב-DNA או RNA, חלבונים רקומביננטיים מבצעים מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות באורגניזמים, כולל קטליזה אנזימטית, הגנה, תמיכה, תנועה וויסות. על פי תפקידיהם בגוף, ניתן לחלק את החומרים הללו לקטגוריות שונות, כגון נוגדנים, אנזימים, מרכיב מבני. בהתחשב בפונקציות החשובות שלהן, תרכובות כאלה נחקרו באופן אינטנסיבי ונעשה בהן שימוש נרחב.
בעבר, הדרך העיקרית להשיג חלבון רקומביננטי הייתה לבודד אותו ממקור טבעי, שלרוב אינו יעיל וגוזל זמן. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה מולקולרית ביולוגית אפשרה לשבט DNA המקודד קבוצה מסוימת של חומרים לתוך וקטור ביטוי לחומרים כמו חיידקים, שמרים, תאי חרקים ותאי יונקים.
במילים פשוטות, חלבונים רקומביננטיים מתורגמים על ידי מוצרי DNA אקסוגניים לתאים חיים. השגתן כרוכה בדרך כלל בשני שלבים עיקריים:
- שיבוט מולקולה.
- ביטוי חלבון.
כיום, ייצור מבנה כזה הוא אחת השיטות החזקות ביותר המשמשות ברפואה ובביולוגיה. להרכב יש יישום רחב במחקר וביוטכנולוגיה.
כיוון רפואי
חלבונים רקומביננטיים מספקים טיפולים חשובים למחלות שונות כמו סוכרת, סרטן, מחלות זיהומיות, המופיליה ואנמיה. ניסוחים אופייניים של חומרים כאלה כוללים נוגדנים, הורמונים, אינטרלוקינים, אנזימים ונוגדי קרישה. קיים צורך הולך וגובר בתכשירים רקומביננטיים לשימוש טיפולי. הם מאפשרים לך להרחיב את שיטות הטיפול.
חלבונים רקומביננטיים מהונדסים גנטית ממלאים תפקיד מפתח בשוק התרופות הטיפוליות. תאי יונקים מייצרים כיום את החומרים הטיפוליים ביותר מכיוון שהתכשירים שלהם מסוגלים לייצר חומרים דמויי טבעי באיכות גבוהה. בנוסף, חלבונים טיפוליים רקומביננטיים רבים מאושרים מיוצרים ב-E. coli עקב גנטיקה טובה, צמיחה מהירה ותפוקה גבוהה. יש לזה גם השפעה חיובית על פיתוח תרופות המבוססות על חומר זה.
Research
השגת חלבונים רקומביננטיים מבוססת על שיטות שונות. חומרים עוזרים לגלות את העקרונות הבסיסיים והבסיסיים של הגוף. ניתן להשתמש במולקולות אלו כדי לזהות ולקבועמיקום החומר המקודד על ידי גן מסוים, ולחשוף את תפקודם של גנים אחרים בפעילויות סלולריות שונות כגון איתות תאים, מטבוליזם, גדילה, שכפול ומוות, שעתוק, תרגום ושינוי של התרכובות הנדונות במאמר.
לכן, ההרכב הנצפה משמש לעתים קרובות בביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של תאים, ביוכימיה, מחקרים מבניים וביופיזיקליים ותחומים רבים אחרים של מדע. יחד עם זאת, השגת חלבונים רקומביננטיים היא נוהג בינלאומי.
תרכובות כאלה הן כלים שימושיים בהבנת אינטראקציות בין-תאיות. הם הוכחו כיעילים במספר שיטות מעבדה כגון ELISA ואימונוהיסטוכימיה (IHC). ניתן להשתמש בחלבונים רקומביננטיים לפיתוח מבחני אנזימים. בשימוש בשילוב עם זוג נוגדנים מתאימים, ניתן להשתמש בתאים כסטנדרטים לטכנולוגיות חדשות.
ביוטכנולוגיה
חלבונים רקומביננטיים המכילים רצף חומצות אמינו משמשים גם בתעשייה, ייצור מזון, חקלאות וביו-הנדסה. לדוגמה, בגידול בעלי חיים, ניתן להוסיף אנזימים למזון כדי להגדיל את הערך התזונתי של מרכיבי המזון, להפחית עלויות ובזבוז, לתמוך בבריאות המעי של בעלי חיים, לשפר את התפוקה ולשפר את הסביבה.
בנוסף, חיידקי חומצת חלב (LAB) לאורך זמןשימשו לייצור מזונות מותססים, ולאחרונה פותחה LAB לביטוי של חלבונים רקומביננטיים המכילים רצף חומצות אמינו, שניתן להשתמש בהם באופן נרחב, למשל, לשיפור העיכול של בני אדם, בעלי חיים ותזונתיים.
עם זאת, לחומרים האלה יש גם מגבלות:
- במקרים מסוימים, הייצור של חלבונים רקומביננטיים הוא מורכב, יקר ודורש זמן.
- חומרים המיוצרים בתאים עשויים שלא להתאים לצורות טבעיות. הבדל זה יכול להפחית את היעילות של חלבונים רקומביננטיים טיפוליים ואף לגרום לתופעות לוואי. בנוסף, הבדל זה עשוי להשפיע על תוצאות הניסויים.
- הבעיה העיקרית בכל התרופות הרקומביננטיות היא אימונוגניות. כל מוצרי הביוטק יכולים להפגין צורה כלשהי של אימונוגניות. קשה לחזות את בטיחותם של חלבונים טיפוליים חדשים.
באופן כללי, ההתקדמות בביוטכנולוגיה הגדילה והקלה על ייצור חלבונים רקומביננטיים למגוון יישומים. למרות שעדיין יש להם כמה חסרונות, החומרים חשובים ברפואה, מחקר וביוטכנולוגיה.
קישור למחלה
חלבון רקומביננטי אינו מזיק לבני אדם. זה רק חלק בלתי נפרד מהמולקולה הכוללת בפיתוח של תרופה מסוימת או אלמנט תזונתי. מחקרים רפואיים רבים הראו שביטוי מאולץ של חלבון FGFBP3 (בקיצור BP3) בזן מעבדה של עכברים שמנים הראה ירידה משמעותית בשומן הגוף שלהם.מסה, למרות הנטייה הגנטית לשימוש.
תוצאות הניסויים הללו מראות שחלבון FGFBP3 עשוי להציע טיפול חדש להפרעות הקשורות לתסמונת מטבולית כגון סוכרת מסוג 2 ומחלת כבד שומני. אבל מכיוון ש-BP3 הוא חלבון טבעי ולא תרופה מלאכותית, ניסויים קליניים של BP3 אנושי רקומביננטי יכולים להתחיל לאחר הסבב האחרון של מחקרים פרה-קליניים. כלומר, ישנן סיבות הקשורות לבטיחות ביצוע מחקרים כאלה. החלבון הרקומביננטי אינו מזיק לבני אדם בשל עיבודו וטיהורו הדרגתיים. שינויים מתרחשים גם ברמה המולקולרית.
PD-L2, אחד משחקני המפתח באימונותרפיה, היה מועמד לפרס נובל לפיזיולוגיה או רפואה לשנת 2018. עבודה זו, שהתחילה על ידי פרופ' ג'יימס פ. אליסון מארה ב ופרופ' טאסוקו הונג'ו מיפן, הובילה לטיפול בסוגי סרטן כגון מלנומה, סרטן ריאות ואחרים על בסיס אימונותרפיה בנקודות ביקורת. לאחרונה, AMSBIO הוסיפה מוצר חדש מרכזי לקו האימונותרפיה שלה, המפעיל PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
בניסויים הוכחת מושג, חוקרים מאוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם, בראשות H. Long Zheng, MD, פרופסור רוברט B. Adams, ומנהל רפואת מעבדה, המחלקה לפתולוגיה, בית הספר של UAB רפואה, הדגישו כטיפול פוטנציאלי הפרעת דימום נדירה אך קטלנית, TTP.
התוצאות של זהמחקרים מראים לראשונה שעירוי של טסיות עמוסות rADAMTS13 עשויה להיות גישה טיפולית חדשה ועשויה להיות יעילה לפקקת עורקים הקשורה ל-TTP מולד ותיווך חיסוני.
חלבון רקומביננטי הוא לא רק חומר מזין, אלא גם תרופה בהרכב התרופה המפותחת. אלו הם רק כמה תחומים שעוסקים כעת ברפואה וקשורים לחקר כל המרכיבים המבניים שלה. כפי שמראה הפרקטיקה הבינלאומית, המבנה של חומר מאפשר ברמה המולקולרית להתמודד עם בעיות חמורות רבות בגוף האדם.
פיתוח חיסון
חלבון רקומביננטי הוא קבוצה ספציפית של מולקולות שניתן לעצב. מאפיין דומה משמש בפיתוח חיסונים. אסטרטגיית חיסון חדשה, הידועה גם כשימוש בזריקת וירוס רקומביננטית מיוחדת, יכולה להגן על מיליוני תרנגולות בסיכון ממחלה קשה בדרכי הנשימה, אמרו חוקרים מאוניברסיטת אדינבורו וממכון פירברייט. חיסונים אלה משתמשים בגרסאות לא מזיקות או חלשות של וירוס או חיידק כדי להחדיר חיידקים לתאי הגוף. במקרה זה, מומחים השתמשו בנגיפים רקומביננטיים עם חלבוני ספייק שונים כחיסונים כדי ליצור שתי גרסאות של וירוס לא מזיק. ישנן תרופות רבות ושונות שנבנו סביב הקשר הזה.
השמות המסחריים והאנלוגים של חלבון רקומביננטי הם כדלקמן:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
אלו בעיקר תרופות אנטי-סרטניות, אך ישנם תחומי טיפול נוספים הקשורים לחומר הפעיל הזה.
חיסון חדש, הנקרא גם LASSARAB, שנועד להגן על אנשים הן מפני קדחת לאסה והן נגד כלבת, הראה תוצאות מבטיחות במחקרים פרה-קליניים, כך עולה ממחקר חדש שפורסם בכתב העת המדעי Nature Communications. מועמד לחיסון רקומביננטי מומת משתמש בנגיף כלבת מוחלש.
צוות המחקר הכניס חומר גנטי של וירוס לאסה לווקטור של וירוס הכלבת, כך שהחיסון יבטא חלבוני פני השטח גם בתאי לאסה וגם בתאי כלבת. תרכובות פני השטח הללו מעוררות תגובה חיסונית נגד גורמים זיהומיים. אז חיסון זה הושבת כדי "להרוס" את נגיף הכלבת החי ששימש לייצור הנשא.
קבלת שיטות
ישנן מספר מערכות לייצור חומר. השיטה הכללית להשגת חלבון רקומביננטי מבוססת על קבלת חומר ביולוגי מהסינתזה. אבל יש דרכים אחרות.
כיום ישנן חמש מערכות ביטוי עיקריות:
- מערכת ביטוי E. coli.
- מערכת ביטוי שמרים.
- מערכת ביטוי תאי חרקים.
- מערכת ביטוי של תאים יונקים.
- מערכת ביטוי חלבון ללא תאים.
האופציה האחרונה מתאימה במיוחד לביטוי של חלבונים טרנסממברנייםותרכובות רעילות. בשנים האחרונות, חומרים שקשה לבטא בשיטות תוך-תאיות קונבנציונליות שולבו בהצלחה בתאים במבחנה. בבלארוס נעשה שימוש נרחב בייצור חלבונים רקומביננטיים. ישנם מספר מפעלים בבעלות המדינה העוסקים בנושא זה.
Cell Free Protein Synthesis System היא שיטה מהירה ויעילה לסינתזה של חומרי מטרה על ידי הוספת מצעים ותרכובות אנרגיה שונות הנחוצות לשעתוק ולתרגום במערכת האנזימטית של תמציות תא. בשנים האחרונות הופיעו בהדרגה היתרונות של שיטות נטולות תאים לסוגי חומרים כגון ממברנות מורכבות ורעילות, המדגימות את היישום הפוטנציאלי שלהן בתחום הביו-פרמצבטי.
טכנולוגיה ללא תאים יכולה להוסיף מגוון של חומצות אמינו שאינן טבעיות בקלות ובצורה מבוקרת כדי להשיג תהליכי שינוי מורכבים שקשה לפתור לאחר ביטוי רקומביננטי קונבנציונלי. לשיטות כאלה יש ערך יישום גבוה ופוטנציאל לאספקת תרופות ופיתוח חיסונים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס. מספר רב של חלבוני ממברנה בוטאו בהצלחה בתאים חופשיים.
ביטוי של יצירות
חלבון רקומביננטי CFP10-ESAT 6 מיוצר ומשמש ליצירת חיסונים. אלרגן שחפת כזה מאפשר לך לחזק את המערכת החיסונית ולפתח נוגדנים. באופן כללי, מחקרים מולקולריים כוללים מחקר של כל היבט של חלבון, כגון מבנה, תפקוד, שינויים, לוקליזציה או אינטראקציות. כדי לחקורכיצד חומרים ספציפיים מווסתים תהליכים פנימיים, חוקרים בדרך כלל דורשים את האמצעים לייצר תרכובות פונקציונליות בעלות עניין ותועלת.
בהתחשב בגודלם ובמורכבותם של חלבונים, סינתזה כימית אינה אפשרות מעשית למאמץ זה. במקום זאת, תאים חיים והמנגנון הסלולרי שלהם משמשים בדרך כלל כמפעלים ליצירה ובנייה של חומרים המבוססים על התבניות הגנטיות המסופקות. מערכת ביטוי החלבון הרקומביננטי יוצרת אז את המבנה הדרוש ליצירת תרופה. לאחר מכן מגיעה בחירת החומר הדרוש לקטגוריות שונות של תרופות.
בניגוד לחלבונים, קל לבנות DNA באופן סינתטי או במבחנה באמצעות טכניקות רקומביננטיות מבוססות. לכן, ניתן לעצב תבניות DNA של גנים ספציפיים, עם או בלי רצפי מדווחים או רצפי תג זיקה, כתבניות לביטוי של החומר המנוטר. תרכובות כאלה המופקות מתבניות DNA כאלה נקראות חלבונים רקומביננטיים.
אסטרטגיות מסורתיות לביטוי של חומר כוללות טרנספקציה של תאים עם וקטור DNA המכיל תבנית ולאחר מכן תרבית התאים כדי לתמלל ולתרגם את החלבון הרצוי. בדרך כלל, התאים עוברים ליטוש כדי לחלץ את התרכובת המובעת לטיהור לאחר מכן. החלבון הרקומביננטי CFP10-ESAT6 מעובד בצורה זו ועובר מערכת טיהור מאפשרותהיווצרות רעלים. רק לאחר מכן הוא עובר לסונתז לחיסון.
הן פרוקריוטיות והן אוקריוטיות במערכות ביטוי in vivo עבור חומרים מולקולריים נמצאים בשימוש נרחב. בחירת המערכת תלויה בסוג החלבון, הדרישה לפעילות תפקודית, והתשואה הרצויה. מערכות ביטוי אלו כוללות יונקים, חרקים, שמרים, חיידקים, אצות ותאים. לכל מערכת יש יתרונות ואתגרים משלה, ובחירה במערכת המתאימה ליישום מסוים חשובה לביטוי מוצלח של החומר הנבדק.
ביטוי מיונקים
השימוש בחלבונים רקומביננטיים מאפשר פיתוח חיסונים ותרופות ברמות שונות. לשם כך ניתן להשתמש בשיטה זו להשגת חומר. ניתן להשתמש במערכות ביטוי של יונקים להפקת חלבונים מממלכת החיות בעלי המבנה והפעילות המקומיים ביותר בשל הסביבה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית. זה מביא לרמות גבוהות של עיבוד פוסט-תרגום ופעילות פונקציונלית. ניתן להשתמש במערכות ביטוי יונקים לייצור נוגדנים, חלבונים מורכבים ותרכובות לשימוש במבחנים תפקודיים מבוססי תאים. עם זאת, יתרונות אלו יחד עם תנאי תרבות מחמירים יותר.
ניתן להשתמש במערכות ביטוי יונקים ליצירת חלבונים באופן חולף או דרך שורות תאים יציבות שבהן מבנה הביטוי משולב בגנום המארח. בעוד שמערכות כאלה יכולות לשמש בניסויים מרובים, הזמןייצור יכול ליצור כמות גדולה של חומר תוך שבוע עד שבועיים. לסוג זה של ביוטכנולוגיה חלבון רקומביננטי יש ביקוש גבוה.
מערכות הביטוי של יונקים חולפות, בעלות תשואה גבוהה, משתמשות בתרביות תרחיף ויכולות להניב גרמים לליטר. בנוסף, לחלבונים אלה יש יותר קיפול מקורי ושינויים לאחר תרגום כגון גליקוזילציה בהשוואה למערכות ביטוי אחרות.
ביטוי חרקים
שיטות לייצור חלבון רקומביננטי אינן מוגבלות ליונקים. ישנן גם דרכים פרודוקטיביות יותר מבחינת עלויות הייצור, אם כי התפוקה של החומר לליטר נוזל מטופל נמוכה בהרבה.
ניתן להשתמש בתאי חרקים כדי לבטא חלבון ברמה גבוהה עם שינויים הדומים למערכות יונקים. ישנן מספר מערכות שניתן להשתמש בהן ליצירת בקולווירוס רקומביננטי, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לחלץ את החומר המעניין בתאי חרקים.
ניתן להגדיל בקלות ביטויים של חלבונים רקומביננטיים ולהתאים אותם לתרבית תרחיפים בצפיפות גבוהה להרכבה בקנה מידה גדול של מולקולות. הם דומים יותר מבחינה תפקודית להרכב המקומי של חומר יונקים. למרות שהתפוקה יכולה להיות עד 500 מ ג/ליטר, הייצור של בקולובירוס רקומביננטי יכול לקחת זמן רב ותנאי התרבות קשים יותר ממערכות פרוקריוטיות. עם זאת, במדינות דרומיות וחמות יותר, דומההשיטה נחשבת ליעילה יותר.
ביטוי חיידקי
ניתן לבסס ייצור חלבונים רקומביננטיים בעזרת חיידקים. טכנולוגיה זו שונה בהרבה מאלה שתוארו לעיל. מערכות ביטוי חלבון חיידקי פופולריות מכיוון שקל להתרבות את החיידקים, גדלים במהירות ומעניקים תפוקות גבוהות של הניסוח הרקומביננטי. עם זאת, חומרים איקריוטיים מרובי דומיינים המתבטאים בחיידקים לרוב אינם פונקציונליים מכיוון שתאים אינם מצוידים לבצע את השינויים הדרושים לאחר תרגום או קיפול מולקולרי.
בנוסף, חלבונים רבים הופכים לבלתי מסיסים כמולקולות הכללה, שקשה מאוד לשחזר אותן ללא דנטורטורים קשים והליכי קיפול מולקולריים מסורבלים לאחר מכן. שיטה זו נחשבת ברובה כעדיין ניסיונית ברובה.
ביטוי חופשי סלולרי
חלבון רקומביננטי המכיל את רצף חומצות האמינו של staphylokinase מתקבל בצורה מעט שונה. הוא כלול בסוגים רבים של הזרקות, הדורשות מספר מערכות לפני השימוש.
ביטוי חלבון חופשי מתאים הוא סינתזה חוץ גופית של חומר תוך שימוש בתמציות תא שלמות תואמות תרגום. באופן עקרוני, תמציות תאים שלמים מכילות את כל המקרומולקולות והרכיבים הנדרשים לתעתוק, תרגום ואפילו שינוי לאחר תרגום.
רכיבים אלה כוללים RNA פולימראז, גורמי חלבון רגולטוריים, צורות שעתוק, ריבוזומים ו-tRNA. בעת הוספהקו-פקטורים, נוקלאוטידים ותבנית גנים ספציפית, תמציות אלו יכולות לסנתז חלבונים בעלי עניין תוך מספר שעות.
למרות שאינן בנות קיימא לייצור בקנה מידה גדול, מערכות ללא תאים או ביטוי חלבון במבחנה (IVT) מציעות מספר יתרונות על פני מערכות in vivo קונבנציונליות.
ביטוי ללא תאים מאפשר סינתזה מהירה של ניסוחים רקומביננטיים מבלי לערב תרבית תאים. מערכות נטולות תאים מאפשרות לסמן חלבונים בחומצות אמינו מותאמות, וכן לבטא תרכובות העוברות פירוק פרוטאוליטי מהיר על ידי פרוטאזות תוך תאיות. בנוסף, קל יותר לבטא חלבונים רבים ושונים בו-זמנית באמצעות שיטה נטולת תאים (לדוגמה, בדיקת מוטציות חלבון על ידי ביטוי בקנה מידה קטן מתבניות DNA רקומביננטי רבות ושונות). בניסוי מייצג זה, נעשה שימוש במערכת ה-IVT לביטוי חלבון הקספאז-3 האנושי.
מסקנות וסיכויים עתידיים
ניתן לראות כעת בייצור חלבון רקומביננטי כמשמעת בוגרת. זוהי תוצאה של שיפורים מצטברים רבים בטיהור ובניתוח. נכון לעכשיו, תוכניות גילוי תרופות מופסקות לעתים רחוקות עקב חוסר היכולת לייצר את חלבון המטרה. תהליכים מקבילים לביטוי, טיהור וניתוח של כמה חומרים רקומביננטיים ידועים כיום במעבדות רבות ברחבי העולם.
תסביכי חלבונים והצלחה גוברת בייצורמבני ממברנה ממוססים ידרשו שינויים נוספים כדי לעמוד בקצב הביקוש. הופעתם של ארגוני מחקר חוזים יעילים לאספקה סדירה יותר של חלבונים תאפשר הקצאה מחדש של משאבים מדעיים כדי לעמוד באתגרים החדשים הללו.
בנוסף, זרימות עבודה מקבילות אמורות לאפשר יצירת ספריות שלמות של החומר המנוטר כדי לאפשר זיהוי יעדים חדשים וסריקה מתקדמת, יחד עם פרויקטים מסורתיים של גילוי תרופות מולקולות קטנות.
